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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步

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  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实 聚丙烯酰胺凝胶电泳 实 验原理和操作步骤 实验原理: 实验原理: SDS-PAGE 是对蛋白质进行量化, 是对蛋白质进行量化, 比较及特性鉴定的一种经济、 比较及特性鉴定的一种经济、 快速、 该法是依据混合蛋白的分子量不同来 快速、而且可重复的方法。 而且可重复的方法。 进行分离的。 进行分离的。 SDS 是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折 是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合, 叠结构,并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。 叠结构,并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS 蛋白 质复合物的长度与其分子量成正比。 在样品介质和凝胶中加入强 质复合物的长度与其分子量成正比。 还原剂和去污剂后, 蛋白亚基的迁移率取决 还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。 电荷因素可被忽略。 于亚基分子量。 于亚基分子量。 试剂和器材: 试剂和器材: 试 剂 : 1. 5x 样 品 缓 冲 液 ( 10ml ) :0.6ml 1mol/L 的 Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油,2ml 10%的 SDS,0.5ml 巯基 甘油, 甘油 的 , 乙醇, 溴酚蓝, 蒸馏水。可在4℃保存数周, 乙醇,1ml 1%溴酚蓝,0.9ml 蒸馏水。可在 ℃保存数周,或在 溴酚蓝 -20℃保存数月。 ℃保存数月。 2. 凝胶贮液:在通风橱中,称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺 凝胶贮液:在通风橱中,称取丙烯酰胺 , 0.8g, ,加重蒸水溶解后, 过滤后置棕色瓶中, ℃ 加重蒸水溶解后,定容到100ml。 定容到 。过滤后置棕色瓶中,4℃ 保存,一般可放置 个月 个月。 保存,一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液: Tris 36.3g ,加1mol/L HCl 48ml, 分离胶缓冲液: 分离胶缓冲液 , 加重蒸水80ml 使其溶解,调 pH8.9,定容至 使其溶解, 加重蒸水 ,定容至100ml, 4℃保存。 , ℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液: Tris 5.98g ,加1mol/L HCl 48ml, 浓缩胶缓冲液: 浓缩胶缓冲液 , 加重蒸水80ml 使其溶解,调 pH6.7,定容至 使其溶解, 加重蒸水 ,定容至100ml, 4℃保存。 , ℃保存。 5. TEMED(四乙基乙二胺)原液 (四乙基乙二胺) 6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制) 过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制) 过硫酸铵 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液: 甘氨酸电极缓冲液: 甘氨酸28.8g, 甘氨酸电极缓冲液 称取 Tris 6.0g, , 甘氨酸 , 加蒸馏水约900ml, pH8.3后, , 调 用蒸馏水定容至1000ml。 4℃ 加蒸馏水约 后 用蒸馏水定容至 。 ℃ 置 保存,临用前稀释 倍 保存,临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝 G250染色液:称100mg 考马斯亮蓝 G250,溶 染色液: 染色液 , 蒸馏水中 慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸,最后补足水 的过氯酸, 于200ml 蒸馏水中,慢慢加入 的过氯酸 小时, 到250ml,搅拌 小时,小孔滤纸过滤。 ,搅拌1小时 小孔滤纸过滤。 器材:电泳仪,电泳槽,水浴锅,摇床。 器材:电泳仪,电泳槽,水浴锅,摇床。 实验操作 (一)样品制备 将蛋白质样品与5X 将蛋白质样品与 样品缓冲液 20ul+5ul) ( + ) 在一个 Eppendorf 管中混合。放入 管中混合。放入100℃加热 5-10min,取上清点样。 ℃ - ,取上清点样。 (二)分离胶及浓缩胶的制备1 将玻璃板、样品梳、Spacer 用 分离胶及浓缩胶的制备 将玻璃板、样品梳、 洗涤剂洗净, 冲洗数次,再用乙醇擦拭,晾干; 洗涤剂洗净,用 ddH2O 冲洗数次,再用乙醇擦拭,晾干; 2 将两块洗净的玻璃板之间加入 Spacer,按照 Bio-Rad Mini , Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板; Ⅲ说明书提示装好玻璃板; 3 按如下体积配制 %分离胶8.0 ml,混匀; 按如下体积配制10%分离胶 ,混匀; ddH2O 3.0 ml 1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml 30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul 10%AP 56 ul TEMED 6 ul 4 向玻璃板间灌制分离胶,立即覆一层重蒸水,大约20 min 后 向玻璃板间灌制分离胶,立即覆一层重蒸水,大约 胶即可聚合; 胶即可聚合; 5 按 如 下 体 积 配 制 6 % 浓 缩 胶 3.0 ml , 混 匀 ; ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30% Acr-Bis 2.0 ml 400 ul 600 ul 10% SDS 10% AP TEMED 36ul 24ul 4ul 6 将上层重蒸水倾去,滤纸吸干,灌制浓缩胶,插入样品梳; 将上层重蒸水倾去,滤纸吸干,灌制浓缩胶,插入样品梳; 7 装好电泳系统,加入电极缓冲液,上样20 ?l; 装好电泳系统,加入电极缓冲液,上样 8 稳压 稳压200V, , 溴酚蓝刚跑出分离胶时, 停止电泳, 约需45 min~ 溴酚蓝刚跑出分离胶时, 停止电泳, 约需 ~ 1hr. 9 卸下胶板,剥离胶放入染色液中,室温染色1~2 hr;加入脱 卸下胶板,剥离胶放入染色液中,室温染色 ~ ; 色液, 置于80 rpm 脱色摇床上 每20 min 更换一次脱色液 10 ml 脱色摇床上,每 色液, 置于 ( 冰乙酸; 乙醇; 蒸馏水)至完全脱净。 冰乙酸;45 ml 乙醇;45 ml 蒸馏水)至完全脱净。

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