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欢乐彩SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理_四年级数学_数学_小学教育_教育专区。PAGE胶制作原理

  聚丙烯酰氨凝胶电泳 作用原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构,具有分子筛效应,它有两种形式,一种是 非变性聚丙烯酰胺凝胶,蛋白质在电泳中保持完整的状态,蛋白在其中依三种因 素分开:蛋白大小,形状和电荷。 而 SDS-PAGE 仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是 1967 年由 shapiro 建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污 剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷 因素可以忽视。 SDS 是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的 氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇, 二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS 后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和 SDS 结合成蛋白- SDS 胶 束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量,这样就消除了不同分子间的电 荷差异和结构差异。 SDS-PAGE 一般采用的是不连续缓冲系统,于连续缓冲系统相比,能够有较 高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在 浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和 浓缩胶选 TRIS/HCL 缓冲液,电极液选 TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCL 解离成氯 离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移 动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率 最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因 而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面, 使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis)方法可对蛋白质的组分进行分离,并可精确测得蛋白质的分 子量。常用的方法为 SDS-PAGE 不连续系统。 基本原理:聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺(acrylamide)和 N,N’-亚甲基双丙 稀酰胺(N,N’-methylene bis acrylamide)经共聚合而成。此聚合过程是由四 甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED)和过硫酸胺(ammonium persulfate, 激发的。 AP) 被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸, 正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺, 使多聚链交叉互连成为网状立 体结构,最终多聚链聚合成凝胶状。 丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质,是生产聚丙烯酰胺的原料。聚丙烯酰胺 主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。淀粉类食品在高温 ( 120℃)烹调下容易产生丙烯酰胺。 研究表明,人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触丙 烯酰胺,饮水是其中的一条重要接触途径。 丙烯酰胺进入体内又可通过多种途径被人体吸收, 其中经消化道吸收 最快。进入人体内的丙烯酰胺约 90%被代谢,仅少量以原形经尿液排出。丙烯 酰胺进入体内后,会在体内与 DNA 上的鸟嘌呤结合形成加合物,导致遗传物质损 伤和基因突变。 对接触丙烯酰胺的职业人群和偶然暴露于丙烯酰胺人群的调查表明, 丙烯 酰胺具有神经毒性作用, 但目前还没有充足的证据表明通过食物摄入丙烯酰胺与 人类某种肿瘤的发生有明显关系。 丙烯酰胺简介 丙烯酰胺是一种有机化合物,别名 AM;纯品为白色结晶固体,易溶于水、 甲醇、乙醇、丙醇,稍溶于乙酸乙酯、氯仿,微溶于苯,在酸碱环境中可水解成 丙烯酸。职业性接触主要见于丙烯酰胺生产和树脂、黏合剂等的合成,在地下建 筑、改良土壤、油漆、造纸及服装加工等行业也有接触机会。日常生活中,丙烯 酰胺可见于吸烟、经高温加工处理的淀粉食品及饮用水中。 N.N-亚甲基双丙烯酰胺,别名 MBA,双叫 N.N-甲叉双丙烯酰胺,次甲基双丙 烯酰胺,N.N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末,无味,吸湿性极小。遇高 温或强光则自交联,微溶于水、乙醇。 丙烯酰胺单体和交联剂 N1 N′-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成 含有酰胺基侧链的脂肪族长链。 相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维 网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。 N, N -亚甲基双丙烯酰胺又名甲撑双丙烯酰胺 , 英文缩写名 MBA, 为白色 或浅黄色粉末状结晶 , 毒性低 , 对皮肤无刺激 , 无神经毒性 , 溶于水及乙 醇、丙酮等有机溶剂。在它的结构中具有两个相同且非常活泼的反应性官能团 , 可作为交联剂 ,能将线性高分子迅速转变为体型高分子 , 制备吸水性聚合物 , 还可与各种离子型单体发生聚合反应 ,使其在石油开采以及医药、 水处理等行业 具有广泛用途。 产品简介: TEMED 即 N,N,N‘,N’-Tetramethylethylenediamine,中文名为 N,N,N‘,N’-四甲基二乙胺。分子式为(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2, 分子量为 116.20。 进口分装,用于配制 PAGE 胶等。TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由基 而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。加入加速剂 TEMED 后聚合马上开始,应立 即将凝胶混匀,迅速灌胶。 保存条件: 4℃保存。 注意事项: 易燃,有腐蚀性,请注意防护。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 过硫酸铵 分子式: (NH4)2S2O8 分子量: 228.20 性状:过硫酸铵是一种白色、无味晶体,常作强氧化剂使用,也可用作单体 聚合引发剂。它几乎不吸潮,由于能达到很高的纯度而具有特别好的稳定性,便 于储存。另外,它还具有使用方便、安全等优点。 储存及使用注意事项: 过硫酸铵属于非易燃品,但由于能释放氧而有助燃作用,因此必须在一定条 件下储存。首先必须存放在干燥、密闭的容器中,其次应避免阳光直射、热源、 潮湿等不利因素。另外,一些杂质如脏物、铁锈、少量金属以及还原剂可能引起 过硫酸铵的分解,在存放和使用过程中也必须注意。由于潮湿的过硫酸铵粉末及 其水溶液有漂白和轻微的腐蚀作用,因此使用过程中应避免眼睛、皮肤和衣物直 接与其接触。 过硫酸铵的应用:过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的 自由基。须新鲜配制。过硫酸铵是乳胶或丙烯酸单体聚合液、醋酸乙烯、氯乙烯 等产品的引发剂,同时也是苯乙烯、丙烯腈、丁二烯等胶体发生共聚作用的引发 剂。 过硫酸铵-TEMED(四甲基乙二胺)系统 :在 Acr 和 Bis 的溶液中放入这 个催化系统后,过硫酸铵[(NH4)2S2O8]产生出游离氧原子使单体成为具有游离 基的状态,从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。 这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如,在 pH 8.8 条件下 7%的丙烯酰胺 溶液 30 分钟就能聚合完毕;在 pH 4.3 时聚合很慢,要 90 分钟才能完成。温度 与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合,温度升高聚合更快。如将混合 后的凝胶溶液放在近 0℃的地方,就能延缓聚合。一般来讲,温度过低,有氧分 子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合。 为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨 碍聚合,在聚合前须将溶液分别抽气,然后再混合。 十二烷基硫酸钠 SDS 不连续系统由上层浓缩胶和下层的分离胶组成。浓缩胶(pH6.7,孔径大) 主要作用是使样品浓缩,使样品在未进入分离胶前,被浓缩成很窄的条带,从而 提高分离效果。分离胶(pH8.9,孔径小)通过分子筛效应和电荷效应,把样品 中的各组分按分子量和电荷的大小而分开。 如果要利用凝胶电泳测定某一蛋白 质的分子量就必须将电荷效应去掉或减少到可以忽略不计的程度, 使蛋白质泳动 率的大小完全取决于分子量。 如何去除电荷效应呢?现常用的是十二烷基硫酸钠 (SDS)。SDS 是一种阴离子去污剂。在电泳体系中加入一定浓度的 SDS,SDS 以 一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质分子带负电荷,这种负电荷远 远超过了蛋白质分子原有的电荷, 从而减低或消除了各种蛋白质分子天然电荷的 差异。 SDS 是阴离子型表面活性剂,它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷 的复合物,再与 PAGE 技术结合,则谱带差异更加明显、清晰,并可测定蛋白质 分子量。 SDS-PAGE 只是按照分子大小分离的,而不是根据分子所带的电荷和大小分 离的。 SDS 带有大量负电荷,当其与蛋白质结合时,所带的负电荷大大超过了蛋白 质原有的负电荷,因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异,使蛋白 质均带有相同密度的负电荷,因而可利用 Mr 差异将各种蛋白质分开。 甘氨酸 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含 Tris-甘氨酸 (pH 8.3), 分离胶中含 Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有 0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨 酸分子则组成尾随边界, 在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡 的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处 pH 值较高, 有 利于甘氨酸的离子化,所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之 后,沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后,SDS-蛋白质复合物成一电位和 pH 值 均匀的区带泳动穿过分离胶,并被筛分而依各自的大小得到分离。 浓缩效应:凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶,下层为分离胶。 浓缩胶为大孔胶,缓冲液 pH6.7,分离胶为小孔胶,缓冲液 pH8.9。在上下电泳 槽内充以 Tris—甘氨酸缓冲液(pH8.3),这样便形成了凝胶孔径和缓冲液 pH 值 的不连续性。在浓缩胶中 HCl 几乎全部解离为 Cl-,但只有极少部分甘氨酸解离 为 H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在 pH5 左右,在此条件下其解离度在 HCl 和甘氨酸之间。当电泳系统通电后,这 3 种离子同向阳极移动。其有效泳动率依 次为 Cl->蛋白质>H2NCH2COO-,故 C1-称为快离子,而 Gly- 称为慢离子。电 泳开始后,快离子在前,在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电 压梯度成反比,所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢 离子在快离子后面加速移动。 在快离子和慢离子之间形成—个稳定而不断向阳极 移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间,因此蛋白质离子 就集聚在快慢离子之间被浓缩成—条狭窄带。 这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百 倍。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理: 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH 值和凝胶孔 径,而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效 应和分子筛效应。 1.浓缩效应 样品在电泳开始时,通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般 能浓缩几百倍),然后再被分离。当通电后,在样品胶和浓缩胶中,解离度最大 的 Cl—有效迁移率最大,被称为快离子,解离度次之的蛋白质则尾随其后,解 离度最小的甘氨酸离子(PI=6.0)泳动速度最慢,被称为慢离子。由于快离子的 迅速移动,在其后边形成了低离子浓度区域,即低电导区。电导与电势梯度成反 比,因而可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后 面加速移动。因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面,由 于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间,所以,也就聚集在这个 移动的界面附近,逐渐被浓缩,在到达小孔径的分离胶时,已形成一薄层。 2.电荷效应 当各种离子进入 pH8.9 的小孔径分离胶后,甘氨酸离子的电泳迁 移率很快超过蛋白质,高电势梯度也随之消失,在均一电势梯度和 pH 的分离胶 中, 由于各种蛋白质的等电点不同, 所带电荷量不同, 在电场中所受引力亦不同, 经过一定时间电泳,各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。 3.分子筛效应 由于分离胶的孔径较小,分子量大小或分子形状不同的蛋白质通 过分离胶时,所受阻滞的程度不同,因而;迁移率不同而被分离。此处分子筛效 应是指样品通过一定孔径的凝胶时,受阻滞的程度不同,小分子走在前面,大分 子走在后面,各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。 [毒性] 丙烯酰胺属中等毒类,对眼睛和皮肤有一定的刺激作用,可经皮肤、呼 吸道和消化道吸收, 在体内有蓄积作用, 主要影响神经系统, 急性中毒十分罕见。 密切大量接触可出现亚急性中毒,中毒者表现为嗜睡、小脑功能障碍以及感觉运 动型多发性周围神经病。长期低浓度接触可引起慢性中毒,中毒者出现头痛、头 晕、疲劳、嗜睡、手指刺痛、麻木感,还可伴有两手掌发红、脱屑,手掌、足心 多汗,进一步发展可出现四肢无力、肌肉疼痛以及小脑功能障碍等。 丙烯酰胺 慢性毒性作用最引人关注的是它的致癌性。丙烯酰胺具有致突变作用,可引起哺 乳动物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常。动物试验研究发现,丙烯酰 胺可致大鼠多种器官肿瘤,如乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、 子宫、脑下垂体肿瘤等。但目前还没有充足的人群流行病学证据表明,食物摄入 丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显相关性。国际癌症研究机构(IARC)对其 致癌性进行了评价,将丙烯酰胺列为 2 类致癌物(2A),即人类可能致癌物。其 主要依据为, 丙烯酰胺在动物和人体均可代谢转化为致癌活性代谢产物环氧丙酰 胺。

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