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琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理

  琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理)_生物学_自然科学_专业资料。打印 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径 较大适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺 可

  打印 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径 较大适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺 可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离 DNA 度大小范围较广,不 同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 段。琼脂糖通常用水 平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 聚丙烯酰胺分离小片段 DNA (5-500bp) 效果较好,其分辩力极高,甚至相差 1bp 的 DNA 段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶 电泳很快,可容纳相对大量的 DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰 胺凝胶采用垂直装置进行电泳。 目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳 装置进行 DNA 电泳。 琼脂糖凝胶电泳原理: 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的,主要是由 D-半乳糖和 3,6 脱水 L-半乳糖连接而 成的一种线性多糖。 琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中,通常使 用的浓度是 1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清,注入模板后室温下冷却凝聚即成 琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在 DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之 间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构, 这种交联的结构使琼脂糖凝 胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制, 低浓度的琼脂糖形成较大的孔径,而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂 糖本身没有电荷, 但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取 代, 使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷,引起电泳过程中发生电渗以及样品和 凝胶间的静电相互作用,影响分离效果。 琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质,尤其适合于核酸的提纯、分 析。如浓度为 1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的,对蛋白质的 阻碍作用较小, 这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小,所以适用于 一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术, 如免疫电 泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于 DNA、RNA 分子的分离、分析,由 于 DNA、RNA 分子通常较大,所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用, 这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链 DNA,电泳迁移率 的大小主要与 DNA 分子大小有关,而与碱基排列及组成无关。另外,一些低熔 点的琼脂糖在 62 ℃时熔化,因此其中的样品(如 DNA),可以在加热到熔点的水 浴中放置一段时间,重新溶解到溶液中而回收。 由于琼脂糖凝胶的弹性较差, 难以从小管中取出,所以一般琼脂糖凝胶不适合于 管状电泳, 管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板 状凝胶,用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳,以及 DNA、RNA 的分析。垂 直式电泳应用得相对较少。 目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下: (1) 琼脂糖凝胶电泳操作简单, 电泳速度快, 样品不需事先处理就可以进行电泳。 (2) 琼脂糖凝胶结构均匀,含水量大(约占 98%~99%),近似自由电泳,样品扩 散较自由电流,对样品吸附极微,因此电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好。 (3) 琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测 定。 (4) 电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定。制成干膜可长期保存。 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理: 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为 PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以 聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺 (CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2)2 N,Nmethylenebisacrylamide)聚合而成, 这一聚合过程需要有自由基催化完成。 常用 的催化聚合方法有两种: 化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸 铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED),四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自 由基。溶液的 pH 对聚合作用是重要的,因为过低 pH 没有足够的碱基加速催化 反应,同样过多的氧分子存在,会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时,在加 过硫酸铵之前,混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用,常用于制备浓缩 胶,因为这样制得的凝胶孔度要大些。核黄素在光照射下及有微量氧存在时,产 生自由基使 Acr 发生聚合作用。

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