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欢乐彩琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳三

  琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳三_生物学_自然科学_专业资料。琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳三

  第四节 核酸的凝胶电泳 Nucleic Acid Gel Electrophoresis Content of Table 前 言 一、 琼脂糖凝胶电泳 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、 脉冲场凝胶电泳 前 言 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一, 用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段; 优点:(1)便于分离;(2)便于检测; (3)便于回收: 核酸凝胶电泳的基本原理 1)核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团,呈负离子化状 态;核酸分子在一定的电场强度的电场中,它们会向正 电极方向迁移; 2)由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质, 电泳迁移率(或迁移速度)与分子的摩擦系数成反比。 而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数; 因此,可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶 上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的 核酸分子。 Home 一、 琼脂糖凝胶电泳 Agarose gel electrophoresis (一)凝胶的制备及电泳 (二)DNA的迁移速率决定因素 1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基 对数的常用对数近似成反比; 2 琼脂糖浓度 浓度越低,相同核酸分子迁移越快; 3 DNA的构象 一般同一分子:超螺旋环状>线 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭(EB)插入双链DNA造成其 负电荷减少、刚性和长度增加。 5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用 的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种:标准琼脂糖和低 熔点琼脂糖; 不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型 凝结温度/℃ 35~38 40~42 熔化温度/ ℃ 90~95 85~90 标准琼脂糖 高强度琼脂糖 34~43 修饰的低熔点/ 25~35 凝点琼脂糖 35 8~15 超低熔点 25~30 低黏性低熔点琼 38 脂糖 30 85~95 63~65 65 40~45 70 85 75 不同厂家 生产的不 同商品其 凝结温度 和熔化温 度有一定 差异 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 浓度 (%) 0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0 标 准 (kb) 1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08~4 高强度 (kb) 低熔点 (kb) 低黏度低 溶点(kb) 0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.05~1 0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1 7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较 都是常用电泳缓冲液。三者相比: 1)TAE的缓冲容量最低,如长时间电泳会被消耗,此时凝 胶的阳极一侧将发生酸性化; 2)TBE和TPE比TAE花费稍贵,但有高得多的缓冲容量; 3)双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%; 4)对于高分子质量的DNA,TAE的分辨率略高于TBE或TPE, 对于低分子质量的DNA,欢乐彩TAE要差些。超螺旋DNA在TAE 中的电泳分辨率要好于TBE。 (二) 凝胶载样缓冲液 载样缓冲液:临上样到凝胶加样孔之前与待 电泳的样品相混合的一种缓冲液。 载样缓冲液有三个作用: 1)增加样品密度保证DNA沉入加样孔内; 2)使样品带有颜色便于简化上样过程; 3)其中的染料在电场中以可以预测的泳动速 率向阳极迁移。 6×凝胶载样缓冲液 类型 I 6 ×缓冲液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰FF 4℃ 贮存温度 40% (m/V)蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝 II 0.25%二甲苯氰FF 15% Ficoll(Type400)水溶液 0.25%溴酚蓝 室温 III 0.25%二甲苯氰FF 30%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝 40% (m/V)蔗糖水溶液 4℃ IV 4℃ (三)琼脂糖凝胶中DNA的检测 通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭(ethidium bromide, EB)染色法和SYBR Gold染色法。 1 凝胶的EB染色 使用EB染色注意事项 (1)EB被认为是一种强致癌物质 (2)EB可用来检测单链或双链核酸 (3)EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液, 于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶 中,使用终浓度为0.5 μg/ml 。 (4)当要知道DNA片段准确大小时, 凝胶应在无EB情况下电泳,电泳 结束后再用EB染色。 2 凝胶SYBR Gold的染色 SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商 品名称。其与DNA结合的亲和力高,并 且结合后,能够极大增强荧光信号。 (四) 凝胶中DNA的成像 可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成 像,图像可以直接输出到计算机观察。 (五) 凝胶中DNA的回收 现一般采用试剂盒回收: 存在的主要问题: 1 2 不能有效的回收大片段DNA 不能有效回收少量DNA Home 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis PAGE (一) 聚丙烯酰胺凝胶的本质 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原 产生的自由基的存在下,丙烯酰胺单体的乙烯 基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N,N`-亚甲双丙烯酰胺的 参与下的共聚合反应中,欢乐彩,聚丙烯胺的交联形成 三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功 能交联剂的浓度。 CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺) CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 (N,N`-亚甲双丙烯酰胺) (二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其 碱基组成及序列完全无关。 用途:放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注:迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途:制备高纯度的DNA片段。 (三)DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围 丙烯酰胺浓度 有效分离范围 (%) (bp) 二甲苯氰FF 溴酚蓝 3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0 1000~2000 80~500 60~400 40~200 25~150 6~100 460 260 160 70 60 45 100 65 45 20 15 12 注:N,N`-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; Home 三、 脉冲场凝胶电泳 pulsed-field gel electrophoresis PFGE 为何选PFGE? 超过一定大小的线状双链DNA分子在 琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该 极限长度(40kb)后DNA的迁移速率几 乎与分子大小无关,而主要决定于电场 强度。但 PEGE 解决了这一问题。 (一) PFGE 工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交 替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作 出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来,应 叫交替电场凝胶电泳。 A- -B B+ 脉冲电场电泳示意图 +A (二)PEGE类型 ? 垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) ? 场翻转系统(field inversion) ? 旋转胶系统(rotating gel) ? 箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field) A- B- A+B +B +A +A 垂直交变电场系统 B- 场翻转系统 AB- - +B +A 箝位匀强电场系统 + 旋转胶系统 (三) 影响分辨率的因素 1 脉冲时间(0.1s-1000s):增加脉冲时间分离较 大分子,减少脉冲时间分离较小分子。 2 电压:若固定脉冲时间,增加电场强度就增大 了可分离最大片段的范围,但是太大的电场强度 会导致较小片段泳动的紊乱。 3 电场夹角:电场方向的夹角常为1100 - 1200, 研究证实900夹角也非常有效的。 4 温度:标准琼脂糖电泳基本在室温进行, PFGE一般应在4℃ 进行。较高的温度DNA泳 动较快;但是较高的温度也引起较小片段 的泳动截留和明显的条带变宽。 Home

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